A ivermectina é um agente antiparasitário de amplo espectro aprovado pela FDA ¹ que, nos últimos anos, juntamente com outros grupos, demonstramos ter atividade antiviral contra uma ampla gama de vírus 2 , 3 , 4 , 5 in vitro . Originalmente identificada como um inibidor da interação entre a proteína integrase (IN) do vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1) humana e o heterodímero α / β1 da importina (IMP) responsável pela importação nuclear de IN ⁶ , a ivermectina já confirmou a inibição da enzima nuclear IN importação e replicação do HIV-1 ⁵ . Outras ações da ivermectina foram relatadas ⁷ , mas a ivermectina demonstrou inibir a importação nuclear de hospedeiro (por exemplo,^8 , 9 ) e proteínas virais, incluindo a proteína não estrutural do antígeno tumoral do vírus símio SV40 (T-ag) e do vírus da dengue (DENV) 5 ^{5, 6} . É importanteressaltarque foi demonstrado que limita a infecção por vírus de RNA como DENV 1-4 ⁴ , vírus do Nilo Ocidental ¹⁰ , vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) ³ e gripe ² , com esta atividade de amplo espectro que se acredita ser devida à dependência muitos vírus de RNA diferentes no IMPα / β1 durante a infecção ^11 , 12 . A ivermectina também demonstrou ser eficaz contra o vírus do pseudo-vírus da DNA (PRV) in vitro e in vivo, com o tratamento com ivermectina demonstrando aumentar a sobrevida em camundongos infectados com PRV ¹³ . Não foi observada eficácia para a ivermectina contra o vírus Zika (ZIKV) em camundongos, mas os autores reconheceram que as limitações do estudo justificavam a reavaliação da atividade anti-ZIKV da ivermectina ¹⁴ . Finalmente, a ivermectina foi o foco de um ensaio clínico de fase III na Tailândia em 2014-2017, contra a infecção por DENV, no qual uma dose oral diária única foi considerada segura e resultou em uma redução significativa nos níveis séricos da proteína NS1 viral, mas nenhuma alteração na viremia ou benefício clínico foi observada (ver abaixo) ¹⁵ .

O agente causador da atual pandemia de COVID-19, SARS-CoV-2, é um vírus de RNA de sentido positivo de cadeia simples que está intimamente relacionado ao coronavírus da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV). Estudos sobre proteínas SARS-CoV revelaram um papel potencial para IMPα / β1 durante a infecção no fechamento nucleocitoplasmático dependente de sinal da proteína nucleocapsídeo SARS-CoV 16 , 17 , 18 , que pode afetar a divisão celular hospedeira ^19 , 20 . Além disso, a proteína acessória SARS-CoV ORF6 demonstrou antagonizar a atividade antiviral do fator de transcrição STAT1 sequestrando IMPα / β1 na membrana áspera de ER / Golgi ²¹. Tomados em conjunto, esses relatórios sugeriram que a atividade inibidora do transporte nuclear da ivermectina pode ser eficaz contra o SARS-CoV-2.

Para testar a atividade antiviral da ivermectina em relação à SARS-CoV-2, infectamos células Vero / hSLAM com SARS-CoV-2 isolado Australia / VIC01 / 2020 em um MOI de 0,1 por 2 h, seguido pela adição de 5 μM de ivermectina. O sobrenadante e os grânulos de células foram colhidos nos dias 0-3 e analisados ​​por RT-PCR para a replicação do RNA SARS-CoV-2 ( Fig. 1A / B). Às 24 h, houve uma redução de 93% no RNA viral presente no sobrenadante (indicativo de virions liberados) de amostras tratadas com ivermectina em comparação com o veículo DMSO. Do mesmo modo, foi observada uma redução de 99,8% no RNA viral associado a células (indicativo de virions não liberados e não empacotados) com o tratamento com ivermectina. Por 48 h, esse efeito aumentou para uma redução de ~ 5.000 vezes o RNA viral em amostras tratadas com ivermectina em comparação com amostras de controle, indicando que o tratamento com ivermectina resultou na perda efetiva de praticamente todo o material viral por 48 h. Consistente com essa idéia, nenhuma redução adicional no RNA viral foi observada às 72 h. Como observamos anteriormente 3 , 4 , 5, não foi observada toxicidade da ivermectina em nenhum dos momentos testados, nem nos poços da amostra nem nas amostras isoladas de drogas testadas em paralelo.

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Figura 1 . A ivermectina é um potente inibidor do isolado clínico SARS-CoV-2 Australia / VIC01 / 2020. As células Vero / hSLAM foram infectadas com o isolado clínico SARS-CoV-2 Australia / VIC01 / 2020 (MOI = 0,1) por 2 h antes da adição do veículo (DMSO) ou Ivermectina nas concentrações indicadas. As amostras foram coletadas de 0 a 3 dias após a infecção para quantificação da carga viral usando PCR em tempo real do vírus associado a células ( A ) ou sobrenadante ( B ). IC ₅₀ Os valores foram determinados em experiências subsequentes a 48 h após a infecção com as concentrações indicadas de Ivermectina (tratados em 2 h após a infecção, como por A / B ). A análise de PCR em tempo real triplicada foi realizada em vírus associado a células ( C / E) ou sobrenadante ( D / F ) usando sondas contra os genes SARS-CoV-2 E ( C / D ) ou RdRp ( E / F ). Os resultados representam média ± DP (n = 3). Foram ajustadas três curvas de resposta à dose de parâmetros usando o prisma GraphPad para determinar os valores de IC ₅₀ (indicados). G.Diagrama esquemático da ação antiviral proposta pela ivermectina no coronavírus. O IMPα / β1 se liga à proteína de carga do coronavírus no citoplasma (em cima) e a transloca através do complexo de poros nucleares (NPC) para o núcleo onde o complexo se desintegra e a carga viral pode reduzir a resposta antiviral da célula hospedeira, levando a uma infecção avançada . A ivermectina se liga e desestabiliza o heterodímero Impα / β1, impedindo assim a ligação de Impα / β1 à proteína viral (inferior) e impedindo que ela entre no núcleo. Isso provavelmente resulta em inibição reduzida das respostas antivirais, levando a uma resposta antiviral normal e mais eficiente.

Para determinar ainda mais a eficácia da ivemectina, as células infectadas com SARS-CoV-2 foram tratadas com diluições em série de ivermectina 2 h após a infecção e os pellets de sobrenadante e célula coletados para RT-PCR em tempo real às 48 h ( Fig. 1 C / D ) Como acima, uma redução> 5000 no RNA viral foi observada no pellets de sobrenadante e células de amostras tratadas com 5 μM de ivermectina às 48 h, o que equivale a uma redução de 99,98% no RNA viral nessas amostras. Mais uma vez, não foi observada toxicidade com ivermectina em nenhuma das concentrações testadas. O IC50 do tratamento com ivermectina foi determinado como sendo ∼2μM nessas condições. Sublinhando o fato de que o ensaio realmente detectou especificamente SARS-CoV-2, as experiências de RT-PCR foram repetidas usando iniciadores específicos para o gene RdRp viral ( Fig. 1E / F) ao invés do gene E (acima), com resultados quase idênticos observados tanto para o vírus liberado (sobrenadante) quanto para o vírus associado à célula.

Tomados em conjunto, esses resultados demonstram que a ivermectina possui ação antiviral contra o isolado clínico SARS-CoV-2 in vitro , com uma dose única capaz de controlar a replicação viral em 24 a 48 horas em nosso sistema. Nossa hipótese é que isso é provável pela inibição da importação nuclear de proteínas virais mediada por IMPα / β1 ( Fig. 1 G), como mostrado para outros vírus de RNA ^{4 , 5 , 10} ; confirmação deste mecanismo no caso de SARS-CoV-2 e identificação do SARS-CoV-2 e / ou componente (s) hospedeiro (s) impactado (ver ¹⁰) é um foco importante do trabalho futuro neste laboratório. Por fim, o desenvolvimento de um antivírus eficaz para SARS-CoV-2, se administrado a pacientes no início da infecção, pode ajudar a limitar a carga viral, impedir a progressão grave da doença e a transmissão pessoa a pessoa. O teste comparativo de ivermectina contra outros potenciais antivirais para SARS-CoV-2 com mecanismos alternativos de ação 22 , 23 , 24 , 25 , 26 seria, portanto, importante o mais rápido possível. Este breve relatório levanta a possibilidade de a ivermectina ser um antiviral útil para limitar a SARS-CoV-2, de maneira semelhante às já relatadas 22 , 23 , 24 , 25, 26 ; até que um destes seja provado ser benéfico em um ambiente clínico, todos devem ser perseguidos o mais rápido possível.

A ivermectina possui um perfil de segurança estabelecido para uso humano ^{1 , 12 , 27} e é aprovada pela FDA para diversas infecções parasitárias ^1 , 27 . É importante ressaltar que revisões recentes e metanálises indicam que a ivermectina em altas doses tem segurança comparável ao tratamento padrão em baixas doses, embora não haja evidências suficientes para tirar conclusões sobre o perfil de segurança na gravidez ^28 , 29. O próximo passo crítico na avaliação adicional para possível benefício em pacientes com COVID-19 será examinar um regime de dosagem de adição múltipla que imite o uso atualmente aprovado da ivermectina em humanos. Como observado, a ivermectina foi o foco de um recente ensaio clínico de fase III em pacientes com dengue na Tailândia, no qual uma dose diária única foi considerada segura, mas não produziu nenhum benefício clínico. No entanto, os pesquisadores observaram que um regime posológico melhorado pode ser desenvolvido, com base em dados farmacocinéticos ¹⁵ . Embora o DENV seja claramente muito diferente do SARS-CoV-2, esse projeto de teste deve informar o trabalho futuro no futuro. No total, o presente relatório, combinado com um perfil de segurança conhecido, demonstra que a ivermectina é digna de mais consideração como um possível antiviral SARS-CoV-2.